Algún tiempo después de la derrota de la hechicera, el Joker y Harley Quinn han huido de regreso a Gotham. En medio de su relación abusiva, el Joker rompe con Harley y la echa de su casa. Finalmente, Harley es acogida por un anciano llamado Doc, dueño de un restaurante chino en la ciudad.
Después de recuperarse emocionalmente, Harley sale a la discoteca donde pasa la noche en un club propiedad de Roman Sionis, un gángster sádico con tendencias crueles que se disfraza como un propietario del club nocturno burbujeante. Mientras está en el club, Harley conoce a Dinah Lance, una cantante burlesca que trabaja para Roman. Harley se embriaga y actúa ruidosamente en el club, lo que resulta en que hiera al conductor de Roman. Los matones de Roman arrastran a Harley afuera como consecuencia, pero Dinah la salva antes de que la violencia pueda ocurrir. Impresionado por las habilidades de Dinah, Roman la designa como su nuevo conductor. Dinah deja a Harley en la casa de este último y Harley decide remodelar su vida de muchas maneras, incluyendo cortarse el pelo y adoptar una hiena de una tienda de mascotas exótica (a quien llama después Bruce Wayne). Harley también destruye Ace Chemicals, el lugar donde se había comprometido con Joker antes de convertirse realmente en Harley Quinn.
Mientras tanto, Renee Montoya, un detective de policía en el GCPD, llega a la escena de Ace Chemicals y determina que debido a que Joker y Harley se separaron, será fácil arrestar a este último. Al mismo tiempo, Cassandra Cain, una joven huérfana, roba a Zsasz y roba un diamante que tiene información muy importante. Cass es arrestada posteriormente y, por desesperación, se traga el diamante. Al día siguiente, Harley es interceptada por Montoya mientras camina por Gotham. Harley huye de la escena antes de ser capturado por los hombres de Roman. Zsasz y Dinah le cuentan a Roman sobre el estado de Cassandra. Se muestra que a Roman le gusta usar una máscara negra, que es una obra de arte, mientras tortura a las personas como una táctica de intimidación. Dinah y Zsasz también le informan que capturaron a Harley, y como resultado, han decidido no anticipar represalias del Joker, citando la destrucción de Ace Chemicals por parte de Harley como prueba de que los dos se separaron. Dinah le envía un mensaje de texto a Montoya sobre la situación con Cass, revelando en el proceso que ella es un topo en la organización de Roman. Rompiendo la cuarta pared una vez más, Harley revela a la audiencia que están al día con los eventos de la película. Harley escucha a Roman hablando sobre el diamante y le ofrece recuperarlo a Cass si le perdona la vida. Roman acepta y asigna a Harley un día.
Más tarde, pone una recompensa en la cabeza de Cass "para hacerlo más divertido". Harley se disfraza y entra en el GCPD para recuperar a Cass. Harley saca a Cass de las celdas de detención y las dos huyen a un almacén abandonado. Sin embargo, son emboscadas por matones armados que están motivados por la recompensa de Cass. Harley procede a la batalla y los mata después de inhalar cocaína de una bolsa dañada. La recompensa también atrae a Helena Bertinelli, una vigilante conocida como la "asesina de ballestas". Helena ataca a los mafiosos con la esperanza de vengar a su familia asesinada y también planea usar a Cass con la intención de atraer a Roman. Mientras tanto, Dinah descubre que tiene la capacidad metahumana de gritar a un nivel supersónico. Dinah le envía un mensaje de texto a Montoya sobre la recompensa de Cass, pero el texto es descubierto por Zsasz, quien informa a Roman. Roman se enfurece, ya que le disgusta mucho un subordinado que no sigue las órdenes, y se rasca y daña la cara en el proceso.
Harley y Cass deciden esconderse en el apartamento de Harley. Sin embargo, el apartamento es bombardeado por personas que buscan a Cass y se revela que Doc vendió Harley a Roman. Harley llama a Roman y acepta entregar a Cass a cambio de protección de la recompensa como resultado de la falta de confianza. Roman envía a Zsasz y Dinah para recuperar a Cass. Zsasz droga a Harley, mostrando que Roman no cumplió su trato, y Dinah intenta liberar a Cass. Sin embargo, Zsasz, que ya conocía la traición de Dinah, la ataca, pero Helena la mata inesperadamente y llega al parque de atracciones. Todas las mujeres son arrestadas por Montoya, a quien Dinah había enviado un mensaje de texto con respecto a la situación. Harley logra convencer a las mujeres de que trabajen juntas para luchar contra Roman, a pesar de que las otras se mostraron reacias al principio.
Las mujeres usan el equipo y las armas antiguas de Harley para atacar a las hordas de matones de Roman, que finalmente salen victoriosas. Cass es capturada por Roman y Harley los persigue hasta un muelle cercano. Una vez que Harley los alcanza, Cassandra pone una granada en el traje de Roman y lo mata. Después de destruir el imperio romano, Montoya, Dinah y Helena comienzan Birds of Prey con el dinero de las cuentas del diamante mientras Harley y Cassandra lo empeñan y comienzan su propia compañía juntas.
En una escena de audio posterior a los créditos, Harley está a punto de revelar al público un secreto sobre Batman pero antes de que termine su oración, la película termina.